质谱文献脂质组学分析方法及其应用进展

 

摘要

脂质组学是一种基于高通量的测序技术,可有效研究脂类家族的各种脂质分子,进而阐明脂类物质在生物体中的代谢途径和调控机理。本研究综述了近几年脂质组学分析方法的优缺点及其应用进展,主要介绍了散弹枪脂质组学和基于色谱分离的质谱方法,为今后脂质组学的系统研究奠定基础。

脂类是非常重要的细胞成分,在细胞功能中发挥着关键作用[1]。研究脂质的改变对阐明潜在生物标志物的作用机理及其对各机体的系统影响有着巨大贡献。脂质组学是代谢组学的分支,由于脂质相对其他代谢物具有独特性和功能特异性,现已独立为单独学科;脂质组学分析技术,将用于脂质提取物和完整组织样本的脂质组学分析[2]。

1脂质组学简介

脂质组学,涉及到对单个细胞脂类的精确识别,包括每种脂类中单个原子的类型和数量,以及它们与邻近脂类和蛋白质的立体电子相互作用[3]。脂质组学概念的提出近20年[4],主要研究各机体的脂类物质,鉴定脂类分子在蛋白表达和基因代谢中的调控机制,并分析研究差异脂质及其代谢物的变化规律在机体中的联系和作用[5]。它对各脂类物种的精确量化,在脂类代谢途径、基因调控和系统构建方面发挥着重要作用。

2脂质组学分析方法

主要包括免疫测定方法、散弹枪脂质组学和基于色谱分离的质谱方法[6]。其中,酶联免疫吸附测定法在多数实验室都很流行,操作简单,容易获得,但当较多异构体可与各种抗体交叉反应时,其特异性就存在问题,限制了其用途[7]。现重点介绍散弹枪脂质组学和基于色谱分离的质谱法的优缺点及其应用。

2.1散弹枪脂质组学

又名鸟枪法,它利用每种脂类的独特化学和物理性质,直接从生物样品的有机提取物中对细胞脂质组进行大规模的高通量分析。简而言之,将有机提取物直接注入离子源的方法,被称为散弹枪脂质组学。

它的主要优势是,直接注射时,可在恒定浓度的溶液中获得感兴趣的脂类单个分子物种的分子离子质谱,包括直接注射和电喷雾分离技术在内的散弹枪脂质组学,因其灵敏度高、效率高、重现性好、覆盖面广而成为脂质组学的基本分析技术平台。该方法可直接从提取物中进行脂类的鉴定和定量,不需要进行色谱分离[8]。但该方法不适用于大量样品的分析,当样品量超过30h,可能会交叉污染。综上所述,散弹枪脂质组学是小样本油中脂质简单快速鉴定的一种很好的选择。

基于散弹枪脂质组学独特的特点和使用的质谱仪,至少有3种不同的散弹枪脂质组学方法,包括串联质谱法,以及质量精度更高的基于MS和多维MS-SL(MDMS-SL)已被开发出来,并在文献中得到了很好的记录[9]。MDMS-SL最大限度地利用了离散脂类中固有的独特化学和物理特性,能分析非常低的丰度水平,克服了其他散弹枪脂质组学方法的多数局限性,是直接从生物样品的脂质提取物中分析脂质最有力的工具之一,它可对数千种不同的脂类进行高精度分析[10]。Kui等[11]利用多维质谱的散弹枪脂质组学(MDMS-SL)分析小鼠大脑和心脏脂质提取物,可直接从大脑和心脏提取物中鉴定和描述乙烯醚双甘油酯分子物种,这种方法将有助于识别乙烯醚连接的双甘油酯在脂质代谢和信号传导中的作用,以及它们在疾病状态中的适应性改变。Jun等[12]用MDMS-SL分析了ob/ob小鼠及野生型对照在10、12和16周龄时的心脏、肝脏、肾脏和骨骼肌的细胞脂质体,发现ob/ob小鼠的脂毒性脂类(包括NEFA、溶血磷脂、Cer、DAG和TAG)水平显著高于对照组,脂类的比例在年龄和器官依赖方式下有所不同,揭示了ob/ob小鼠的脂肪生成和脂肪毒性可能有助于胰岛素抵抗,并为糖尿病和肥胖的潜在机制的研究提供了很好的见解。

为研究丙型肝炎病毒HCV诱导的脂质组成变化,Sarah等[13]对全细胞提取物和亚细胞室进行了定量散弹枪脂质组学研究,证实了中性脂质的高水平与人类免疫缺陷病毒形成对比,这些脂病毒颗粒显示出类似于极低密度或低密度脂蛋白(VLDL或LDL)的脂质谱。胆固醇和鞘磷脂生物合成,抑制了细胞中的病毒RNA复制,HCV诱导宿主细胞脂代谢的复杂重构,增强了病毒复制和子代的产生,发现降低胆固醇的药物(如他汀类药物)有助于治疗的成功。Phuyal等[14]对人肺细胞长期暴露于多壁碳纳米管的影响及其对细胞蛋白和脂质的影响进行了研究,利用散弹枪脂质组学分析显示多种脂类的积累,表明长期暴露于低剂量的多壁碳纳米管会改变上皮靶细胞的蛋白质组和脂质组谱。Hu等[15]利用散弹枪脂质组学揭示了SLE患者脂质种类的变化,表明线粒体是七氟醚长时间暴露的主要靶点,导致氧化应激的增加和脂质稳态的改变。Gao等[16]应用改良的MS/MSALLDIAPtd2Gro散弹枪脂质组学方法来量化小鼠各种组织中的Ptd2Gro分子物种,为生物样品中Ptd2Gro(心磷脂)分子种类的定量提供了一种有效和准确的方法,MS/MSALL方法采用1m/z的隔离窗口来选择分子离子,既可收集前体离子的所有片段,又可维持前体与片段之间的连接。Wang等[17]使用基于多维质谱的散弹枪脂质组学方法,在正离子模式下通过Da的中性丢失扫描,对大鼠脊髓样本中的脑苷类进行分析,显示出一簇未知的离子峰。为鉴定这些未知离子峰的结构特征,采用高质量分辨质谱对这些离子进行了质谱2和质谱3分析。大量的证据确定,这些未知的离子峰是单己基烷基酰基甘油(HAAG),包括它们的sn位置异构体和烷基酰基组成异构体。同时,应用开发的方法来鉴定和量化存在于各种小鼠神经组织中的HAAG物种。实现了首次对哺乳动物神经组织样本中HAAG物种的脂质组学研究,为今后未知领域的生物学研究奠定了基础。

散弹枪脂质组学一直应用于植物机体脂类差异鉴定,由于其简单快速,可为油脂品种鉴定、食用油保真度和掺假鉴定提供技术支持。TomásRezanka等[18]使用散弹枪脂质组学方法,分析解释了花生四烯酸含量的微小差异;研究发现一些分子物种,尤其是含有花生四烯酸的分子,在丰度上存在显著差异。基于散弹枪脂质组学方法,Xin等[19]建立了一种快速识别菜籽油中tag、dag、MAGs和FFAs的新型脂质谱分析方法;发现油脂的主要差异不是来自于菜籽的类型,而是与品种直接相关。TAG分子种类的定性和定量检测,可为植物生长发育过程中脂质代谢调控机制的研究提供支持。

2.2质谱法脂质组学

质谱法是目前脂质组学分析最常用的检测方法,具有高通量和灵敏度高的特点,在应用中色谱技术与质谱联用,不仅有助于分离脂质化合物,也具有降低基质干扰的作用[20]。与散弹枪脂质组学相比,基于色谱分离的质谱方法需要更多的内部标准[21]。色谱分离导致内标物和分析物的差异洗脱,而分析物与标准物的共洗脱对补偿基质效应和梯度洗脱过程中不同的电离效率非常重要。

基于色谱分离质谱联用技术的色谱分离原理的不同,可分为气相色谱质谱联用技术(GC-MS)和液相色谱质谱联用技术(LC-MS)[22]。

2.2.1气相色谱-质谱联用法(GC-MS)

GC-MS是一种精密度高、灵敏度高和稳定性强的分析技术[23]。通常对易气化的小分子化合物进行分析,分子量通常小于Da,而对部分热不稳定或不挥发的物质则需进行衍生化处理[24],如糖类、氨基酸等,以增加样品的挥发性。GC-MS峰容量高,重现性良好,以及有标准的数据库,可用于代谢物检索,如NIST数据库(

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